1.纸片扩散法
（1）初筛试验：选用头孢泊肟、头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟或头孢曲松(每片含量均为30μg)药敏纸片中的至少2种，用苗勒-欣顿(MHA)琼脂，标準纸片扩散法测试抑菌环直径，按美国临床实验室标準化委员会(NCCLS)1997年标準进行判断。凡头孢泊肟或头孢他啶的抑菌环直径≤22mm，头孢曲松≤25mm，氨曲南或头孢噻肟≤27mm，均应高度怀疑为ESBLs菌株，应进一步作确认试验来加以确诊。
（2）表型确证试验：用头孢他啶(每片30μg)和头孢他啶加克拉维酸(30μg和10μg)；头孢噻肟(每片30μg)和头孢噻肟加克拉维酸(30μg和10μg);分别测量2种纸片单独及加克拉维酸的抑菌环直径。加克拉维酸和不加克拉维酸的抑菌环直径≥5mm可确认为ESBLs菌株。。
2.微量肉汤稀释法
（1）初筛试验：原理同ESBLs纸片扩散法步骤：将大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌配成相应浊度的菌悬液，加入含有以下浓度药物的微量反应板中，头孢泊肟、头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟、头孢曲松。然后将接种了待测菌的反应板置于35℃环境下，孵育16～18小时后观察细菌在不同药物中的生长现象。
（2）表型确证试验：按照药敏试验的微量肉汤稀释法，将大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌配成相应浊度的菌悬液，加入含有以下梯度浓度药物的微量反应板中，头孢他啶的浓度範围为0.25～128μg/ml，头孢他啶/克拉维酸为0.25/4～128/4μg/ml，头孢噻肟为0.25～64μg/d，头孢噻肟/克拉维酸为0.25/4～64/41μg/ml。置于35℃环境下，孵育16～18小时后观察在不同浓度药物中的生长现象。

ESBL阳性预示对头孢泊肟、头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松和氨曲南等抗菌药物无效。一旦确定为产ESBLs菌株，应立即停止使用第三代头孢菌素和单环β-内醯胺类抗生素的治疗。对付产ESBLs菌株，最有效的抗生素为碳青霉烯类，亚胺培南、美罗培南等较为常用。其次，头霉素类中的头孢西丁、头孢美唑等对其也有效。

产ESBL的克雷伯菌和大肠埃希菌分离株，即使药敏试验时部分药物敏感，均应视为耐所有青霉素、头孢菌素和氨曲南。